Estudio sobre resistencia frente a los bencimidazoles de pequeños estróngilos (Cyathostominae) del equino en el sur de Chile (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

El trabajo se
realizó entre marzo y julio del año 2000 en tres
planteles de equinos ubicados en la Xa Región
de Chile: Ubicados en Valdivia (1), Riñihue (2) y
Frutillar (3). En los planteles de 1 y 2 se habían
establecido programas de
aplicación de BZ desde el año 1979 y, sólo
recientemente, se inició la
administración de lactonas macrocíclicas. El
plantel 3 se formó en el año 1994 y no se ha
aplicado un programa
antihelmíntico regular, siendo sólo
esporádico el uso de BZ.

Se obtuvieron muestras fecales desde el recto de todos
los equinos de los tres planteles y, mediante la técnica
de McMaster modificada por Schmidt (1971), se seleccionaron
aquellos que presentaban recuentos superiores a 150 huevos tipo
estrongilido por gramo de materia fecal
(hpg). En el plantel 1 se trabajó con 32 equinos, en el 2
con 36 y en el 3 con 32.

Siete días después del primer muestreo se
trataron los equinos seleccionados con 7,5 mg/ kg de fenbendazol
(Panacur®, Hoechst Roussel Vet S.A.) y una semana
después del tratamiento se llevó a cabo otro
recuento de huevos. Con los recuentos de huevos antes y
después del tratamiento de los equinos se realizó
la prueba FECR utilizando la siguiente fórmula:

         FECR
(%) = (hpg at – hpg dt) x 100 / hpg
at

FECR: reducción de oviposición
at: antes del tratamiento
hpg: huevos por gramo de materia fecal
dt: después del tratamiento

Para la realización de la prueba EHA fue
necesario detener el desarrollo de
las larvas dentro de los huevos en la materia fecal
inmediatamente después de haber sido obtenidas desde el
recto. Para ello, todas las muestras se sometieron a refrigeración con hielo hasta ser
procesadas en el laboratorio.
Luego de haber realizado el recuento de huevos de cada muestra,
éstas se mantuvieron a 4° C durante la noche y, a la
mañana siguiente se obtuvo el máximo de huevos por
medio de una flotación en una solución saturada de
cloruro de sodio y una posterior sedimentación en un litro
de agua.

Se preparó una solución base de BZ con el
producto
tiabendazol (TBZ) (Sigma, Steinheim) como sustancia pura, en agua
destilada + 0.074% HCl. Después de la adición de
1990 µl de suspensión de huevos a cada pocillo de
placas de cultivo de 24 pocillos (Renner Gmbh, Dannstadt), se
agregaron 10 µl de la solución base de TBZ en 11
diferentes concentraciones. Las concentraciones finales en cada
pocillo fueron: 0.01; 0.03; 0.05; 0.07; 0.09; 0.1; 0.125; 0.15;
0.2; 0.25 y 0.3 µg TBZ/ml. Como control se
preparó un pocillo con agua con 0.074% HCl. Para asegurar
el resultado se realizó una réplica de todas las
concentraciones y del control. Después de una
incubación durante 48 horas, a aproximidamente 26° C,
se detuvo el desarrollode las larvas agregando 2 gotas de
solución de Lugol. Se contaron 100 estadios (larvas
eclosionadas y huevos muertos) en todas las concentraciones y se
determinó la media aritmética entre las
réplicas. Los resultados se corrigieron con los resultados
obtenidos en los pocillos control, y se calculó la
DL50 respectiva, según el análisis de Probit mediante el programa
SigmaPlot 2000, Jandel (von Samson- Himmelstjerna y col., 2002).
La DL50 >0.1 µg TBZ/ml indicó la presencia de
cepas resistentes frente a los BZ en la población de pequeños
estróngilos respectiva de cada equino. En caso de
encontrarse recuentos superiores a 150 hpg después del
tratamiento, se realizó otra prueba de EHA.

Con las DL50 individuales de cada equino se
calculó la DL50 total para cada plantel mediante la media
aritmética de los datos obtenidos
en cada concentración. No se calculó la
desviación estándar.

Con una parte adicional de cada muestra fecal se
realizaron cultivos de larvas mediante la técnica de
Roberts y O’Sullivan (1950). Las larvas obtenidas se
conservaron en etanol 70%. Se mezclaron todas las larvas de cada
muestreo del plantel respectivo y se diferenciaron 100
larvas.

Una correlación de los parámetros
"reducción de oviposición" y DL50 se
determinó según Spearman (Craven y col., 1999)..La
distribución normal de los datos se
examinó según el análisis de
Kolmogorov-Smirnov mediante el programa SigmaStat 2.0, Jandel.
Las diferencias significativas entre los planteles antes y
después del tratamiento en cada plantel se calcularon
mediante las pruebas
"t-student" o "Mann Whitney Sum Test" usando el
mismo programa.

RESULTADOS

Las medias aritméticas de la oviposición
antes y después del tratamiento con fenbendazol se
presentan en el cuadro 1. Hubo diferencia significativa antes y
después del tratamiento en el plantel 3 (p<0.001),
mientras que no se encontró diferencia significativa entre
los recuentos de huevos efectuados en el 2 (P = 0.842) y en el 1
( p = 0.924). La reducción de oviposición (FECR) se
presenta en el cuadro 2. En el plantel 1, el 50% de los valores se
distribuyeron entre 0 y 57%, con una dispersión de la
reducción de la oviposición que alcanzó
87.5%; en el 2 el 50% de los valores se
distribuyeron entre 0 y 53%, con una dispersión de la
reducción de la oviposición que alcanzó un
75%; y, en el 3, el 50% de los valores se encontraron entre 78.2
y 100%, con una dispersión de un 0% (figura 1). Hubo
diferencia significativa (p < 0.001) entre los resultados
obtenidos en el 3 y aquellos obtenidos en el 1 y 2. No hubo
diferencia significativa (p = 0.854) entre las reducciones
obtenidas en el plantel 1 y 2.

Mediante la prueba de eclosión de huevos, EHA, se
encontró una DL50 superior a 0.1 µg
TBZ/ml antes del tratamiento con fenbendazol solamente en el
plantel 2; después del tratamiento se evidenció en
el 1 y en el 2 (cuadro 2). Antes del tratamiento el 50% de los
valores fluctuó en el 1 entre 0.055 y 0.096 µg
TBZ/ml, en el 2 entre 0.113 y 0.15 µg TBZ/ml y en el 3
entre 0.05 y 0.082 µg TBZ/ml con una dispersión de
0.029 – 0.122 µg TBZ/ml. Después del tratamiento el
50% de los valores fluctuó en el 1 entre 0.101 y 0.167
µg TBZ/ml, en el 2 entre 0.130 y 0.159 µg TBZ/ml, y
en el 3 entre 0.067 y 0.099 µg TBZ/ml (figura 2). En el
plantel 1 se diferenciaron significativamente (p<0.001) las
DL50 antes, de aquellas obtenidas después del
tratamiento. En cambio no se
observaron diferencias significativas en plantel 2 (p=0.076) y 3
(p=0.061). Entre 2 y 3 hubo diferencia significativa (p<0.001)
entre las DL50 obtenidas antes y después del
tratamiento. En el 2 y en el 1 se encontró diferencia
significativa antes (p<0.001), pero no después del
tratamiento (p=0.388). En cambio, entre el plantel 1 y 3 no hubo
diferencia (p=0.139) antes, pero sí después del
tratamiento (p=0.017).

No se estableció correlación significativa
entre los parámetros obtenidos mediante la prueba de
reducción de oviposición FECR y los de
DL50 obtenidos mediante la prueba EHA, ni antes
(r=-0.197; p=0.0816) ni después del tratamiento
(r=-0.0674; p=0.647).

Todas las larvas diferenciadas en la materia fecal de
los equinos de los planteles 1 y 2 fueron larvas de
pequeños estróngilos. En cambio, en el 3, se
encontró un 8% de larvas de grandes estróngilos,
antes del tratamiento; después del tratamiento se
encontraron solamente larvas de pequeños
estróngilos. 

DISCUSIÓN

Mediante la prueba de reducción de
oviposición (FECR) y según las indicaciones de la
WAAVP (Coles y col., 1992) se encontró resistencia de
los pequeños estróngilos frente a los
bencimidazoles en los tres planteles de equinos (cuadro 1). Sin
embargo, los resultados del plantel 3 se diferenciaron de
aquellos obtenidos en el 2 y en el 1 que, a su vez, no se
diferenciaron entre sí. Esto último es explicable
ya que el criadero 2 surte de caballos al 1, por lo tanto, se
puede asumir que las cepas de pequeños estróngilos
resistentes fueron trasladadas con los caballos de un plantel al
otro. La aparente discrepancia entre los recuentos de huevos
después del tratamiento (cuadro 1) y los resultados de la
FECR se origina en el hecho de que un recuento de huevos
superior, después del tratamiento, al encontrado antes del
tratamiento se consideró como 0% de reducción de
oviposición.

Mediante la prueba de eclosión de huevos (EHA) y
según las indicaciones de la WAAVP (Coles y col., 1992) se
encontró resistencia en el plantel 2, tanto antes como
después del tratamiento, mientras que en el 1 se
encontró solamente después del
tratamiento.

Várady y col. (2000) describen que los datos
obtenidos mediante las pruebas FECR y EHA son comparables si se
trata de pequeños estróngilos de equinos. Ellos
explican que diferencias ocasionales, también descritas
por Craven y col. (1999), se deben a que ambas pruebas miden
atributos diferentes: la primera mide el efecto letal del
producto frente a los parásitos adultos, en cambio, la
segunda se basa en el efecto ovicida del tiabendazole.
Después del tratamiento de los equinos con fenbendazol, se
encontraron reducciones de la oviposición muy variables en
los tres planteles (figura 1), a pesar de haber sido manejados
como grupo en forma
similar. Es probable que los equinos hayan sido infectados con
una población heterogénea de pequeños
estróngilos, y no se puede partir de la base que el
bencimidazol utilizado haya tenido un efecto similar sobre los
diferentes géneros de pequeños estróngilos.
Ello también puede ser una razón adicional que
explica la ausencia de correlación entre las pruebas
(Craven y col., 1999). Según Young y col. (2000), las
variaciones pueden ser causadas por diferencias
fisiológicas de los animales
examinados y por la diferente fertilidad que tienen los distintos
parásitos. También Nilsson y col. (1989) indican
que es probable que los equinos de un plantel se infecten con
poblaciones de pequeños estróngilos diferentes;
pero por otro lado mencionan que las diferencias en la
reducción de oviposición pueden ser causadas por
variaciones en la dosis del antihelmíntico administrado.
Cabe mencionar que en el presente estudio se establecieron
variaciones considerables de la oviposición de 0 a 66% en
algunos animales no tratados (datos
no presentados), y por ello se puede asegurar que la causa de las
variaciones observadas no debe ser buscada en la
dosificación del antihelmíntico. No fue posible
sacar conclusiones sobre las diferencias en la composición
de la población de parásitos, porque las larvas
obtenidas se conservaron en etanol, lo que les produjo una
deshidratación desformante que impidió la
determinación de los géneros de los pequeños
estróngilos presentes. En este contexto sólo es
importante recordar que la oviposición de los
parásitos en un animal infectado no permite sacar
conclusiones sobre la cantidad de parásitos que tenga el
animal, porque las variaciones de la oviposición dependen
de los parásitos así como también del
huésped. Según Young y col. (2000) la media
aritmética en la reducción de la oviposición
es influida considerablemente por los datos extremos; y en caso
de altas variaciones en los datos una reducción de la
oviposición <90% permite un margen muy pequeño
para definir resistencia a los bencimidazoles porque, con mucha
facilidad, se puede cambiar un diagnóstico negativo por uno positivo y
viceversa. Si se considera la indicación de Craven y col.
(1998), que fijan resistencia cuando hay una reducción de
oviposición inferior al 80%, se habría determinado
resistencia solamente en los predios 1 y 2. Este resultado
también coincide con las diferencias encontradas entre los
datos de reducción de oviposición en los dos
planteles. Sin embargo, la reducción de la
oviposición de 83.9%, muy cercana al límite, es un
claro indicador de una incipiente formación de
resistencia. Por las variaciones arriba mencionadas, Fisher y
col. (1992) aconsejan no hacer interpretaciones individuales,
sino hablar de una tendencia general en un plantel, lo que se
aplicó en el presente estudio.

Según Coles y col. (1992) una DL50 > 0.1
µg TBZ/ml indica presencia de resistencia a los
bencimidazoles para el caso de pequeños estróngilos
del equino. En el presente estudio, la población de
pequeños estróngilos encontrados antes del
tratamiento (DL50 de 0.093 µg TBZ/ml) en el plantel 1
tendría que ser clasificada como sensible a los
bencimidazoles (cuadro 2), mientras que la reducción de
oviposición de 27% indica claramente resistencia a ellos.
Por ese motivo es recomendable disminuir el valor
límite de la DL50 de 0.1 µg TBZ/ml a 0.09 µg
TBZ/ml como indicador de resistencia. De esa forma,
también la población de pequeños
estróngilos en el plantel 3, detectada después del
tratamiento, podría ser clasificada como resistente, lo
que sería justificable en vista de la relativamente baja
reducción de oviposición de 83.9% obtenida
después del tratamiento y que indica que hubo una selección
de individuos resistentes. Un valor límite de 0.09
µg TBZ/ml, comparado con el valor de 0.1 µg TBZ/ml,
en la prueba EHA, significa una probabilidad
menor de un diagnóstico falso positivo. En este contexto
es válido preguntarse si un diagnóstico falso
negativo es de menos trascendencia que un diagnóstico
falso positivo. En general, es dudoso que sea posible determinar
resistencia mediante la fijación de un valor límite
(Ihler y Bjørn, 1996).

Las grandes variaciones de las DL50, observadas mediante
la prueba EHA (figura 2), también hacen sospechar que los
equinos estaban infectados con una población muy
heterogénea de pequeños estróngilos, con
diferentes sensibilidades frente a los bencimidazoles.
Según los límites
indicados por WAAVP (Coles y col., 1992), la prueba de
eclosión de los huevos EHA demostró una
sensibilidad menor que la prueba de reducción de la
oviposición FECR. También Craven y col. (1999)
encontraron resistencia a los bencimidazoles en 79% de los
planteles estudiados por medio de la prueba FECR, mientras que la
prueba EHA indicó resistencias
en 62% de los casos. Según McKenna (1990), la prueba FECR
no es menos sensible que la prueba EHA. Martin y col. (1989), en
estudios con Trichostrongylus colubriformis y Ostertagia sp.,
encontraron que la prueba EHA era menos sensible que la prueba
FECR cuando la cantidad de individuos resistentes de una
población era inferior al 25%. También Grimshaw y
col. (1994) describen una sensibilidad menor de la prueba EHA al
compararla con la prueba FECR. Por los motivos expuestos es
recomendable utilizar y combinar las dos pruebas para obtener
resultados más seguros.
Según Ullrich (1987) debe valorarse como resistencia
cuando la DL96 es superior a 0.15 µg TBZ/ml. Mediante esta
interpretación, habría habido
presencia de pequeños estróngilos resistentes a los
bencimidazoles en los tres planteles (cuadro 2).

Se observó un aumento de las medias
aritméticas de la DL50, como consecuencia del tratamiento
con fenbendazol, en los tres planteles pero solamente en el
plantel 1 se diagnosticó diferencia significativa entre
los datos obtenidos antes y después del tratamiento. Sin
embargo, a pesar de ausencia de diferencia significativa en los
otros planteles, es reconocible la selección de individuos
resistentes.

En el presente estudio se encontró solamente 8%
de grandes estróngilos antes del tratamiento en el plantel
3. Después del tratamiento hubo ausencia de grandes
estróngilos en los cultivos respectivos. Ello confirma lo
observado por Drudge y col. (1979), Dorny y col. (1988), Tolliver
y col. (1993), Ihler (1995), Ihler y Bjørn (1996) y
Borgsteede y col. (1997) que también describen un 100% de
efectividad de los bencimidazoles frente a los grandes
estróngilos y, al mismo tiempo,
resistencia de los pequeños estróngilos. Kelly y
col. (1981) y Tolliver y col. (1993) atribuyen la ausencia de
resistencia de los grandes estróngilos a sus prolongados
períodos prepatentes que sólo permiten una
generación al año. En caso de los pequeños
estróngilos es teóricamente posible que ocurran dos
o tres generaciones en un año. De esa forma, la cantidad
de parásitos bajo presión de
selección es muy superior y la selección de cepas
resistentes es mucho más rápida que en los grandes
estróngilos. El hecho que en los planteles 1 y 3 no se
hayan diagnosticado grandes estróngilos, se puede explicar
por el programa de desparasitaciones con bencimidazoles que,
durante más de 15 años, se llevó a cabo en
el criadero 2.

AGRADECIMIENTOS

Al señor Belisario Monsalve por su gran ayuda en
los quehaceres del laboratorio.

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